Estrategias noveles de ADN recombinante aplicadas al inmunodiagnóstico de las leishmaniasis endémicas en Argentina

Abstract

La leishmaniasis tegumentaria americana (LTA) está conformada por un conjunto de enfermedades parasitarias desatendidas que afectan principalmente a poblaciones de regiones desfavorecidas de varios países americanos incluyendo Argentina. Por este motivo, el diagnóstico temprano y tratamiento de la enfermedad, constituyen aun hoy en día uno de los desafíos principales de los programas de Salud Pública y manejo de enfermedades tropicales en nuestro país y demás países de la región. En este sentido, con el objetivo de implementar nuevos métodos diagnósticos aplicables a las condiciones socioeconómicas de las áreas endémicas para leishmaniasis en esta tesis adaptamos técnicas diagnósticas previamente desarrolladas y diseñamos un sistema de diagnóstico inmunológico empleando antígenos recombinantes noveles. En primer término estimamos y comparamos los parámetros diagnósticos de Sensibilidad, Especificidad y Valores Predictivos de las técnicas kPCR, Frotis, Cultivos de promastigotes y ELISA extracto crudo de Leishmania (Viannia) braziliensis, previamente puesto a punto en la tesis de grado de Bracamonte, 2014. Determinamos que la técnica con mayor sensibilidad fue ELISA extracto crudo, seguida por kPCR, Frotis y cultivos, lo que permitió desarrollar un criterio diagnóstico de inclusión de pacientes para los estudios posteriores con antígenos recombinantes. Además se diseñó una marcha diagnóstica en la cual se incluyeron las técnicas que presentaron los mayores porcentajes de parámetros diagnósticos al ser combinadas, implementando así un diagnostico serológico seguido de uno molecular localizado para arribar a un resultado certero. Posteriormente se expresaron mediante un sistema de expresión bacteriano los antígenos recombinantes MPP, PK, Hsp70 y β-tub, previamente identificados mediante métodos seroproteómicos a partir de un extracto crudo de amastigotes de L. (V.) braziliensis. Dado que durante la expresión de cada uno de estos antígenos se produjo la formación de cuerpos de inclusión como producto de la sobreexpresión bacteriana, se evaluaron y seleccionaron distintos protocolos de expresión, disolución de CI y purificación. Como parte de estudios preliminares de doble titulación se evaluaron todos los antígenos expresados con pooles de sueros, para determinar su capacidad de discriminación entre presencia y ausencia de leishmaniasis tegumentaria Americana. A partir de estos estudios se seleccionaron a Hsp70 y β-tub como candidatos para la detección de LTA en el análisis de 433 muestras positivas o negativas para LTA, basados en su eficiencia diagnóstica. De esta manera r-ELISA-β-tub resulto el sistema más eficaz con Sensibilidad (S), Especificidad (E), Valor Predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN) de 90,84%, 88,39%, 71,26% y 95,26% respectivamente. Finalmente, a partir de los resultados obtenidos, proponemos combinar ELISA extracto crudo con r-ELISA-β-tub en paralelo, lo cual serviría para arribar a una determinación fehaciente de ausencia de LTA empleando en primer lugar el par serológico y continuando con el diagnóstico molecular localizado de kPCR para concluir la presencia de LTA.