Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
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Item Bacterias comensales respiratorias inmunomoduladoras como probióticos de nueva generación y adyuvantes para vacunas(Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, 2024) Ortiz Moyano, Francisco Ramiro; Villena, Julio; Álvarez, Gladis SusanaEn este trabajo de tesis se estudió la capacidad de bacterias comensales respiratorias (BCR) o sus partículas semejantes a bacterias (BLP) para regular beneficiosamente las respuestas inmunes innata y adaptativa en el tracto respiratorio, y reducir la severidad de las infecciones producidas por Streptococcus pneumoniae. Se evaluó además si las BCR inmunomoduladoras o sus BLP pueden ser empleadas como adyuvantes en el desarrollo de nuevas formulaciones vacunales de administración nasal que permitan combatir las infecciones neumocócicas. En la primera etapa se determinó mediante estudios in vivo en ratones, la capacidad de distintas cepas de las especies Corynebacterium pseudodiphtheriticum y Dolosigranulum pigrum, administradas por vía nasal, para mejorar la inmunidad respiratoria innata mediada por TLR2 o inducida por el desafío con S. pneumoniae. Se seleccionaron C. pseudodiphtheriticum 090104 y D. pigrum 040417 por su habilidad para modular diferencialmente la producción de IFN-β, IFN-γ e IL-10 en el tracto respiratorio, reducir el daño inflamatorio mediado por TLR2 e incrementar la protección contra S. pneumoniae. En una segunda etapa se estudió el efecto de las cepas 090104 y 040417, así como de sus BLP, sobre las células inmunes del tracto respiratorio. Los estudios in vivo e in vitro demostraron que las BCR y sus BLP inducen la activación de las células dendríticas pulmonares y de los macrófagos alveolares (MAs). Se observó que C. pseudodiphtheriticum 090104 y su BLP fueron las más eficientes para estimular a los MAs e incrementar su capacidad para producir IFN-γ, IL-6, TNF-α e IL-10 en respuesta al desafío con S. pneumoniae. A continuación de evaluó el efecto de la cepa 090104 y su BLP sobre la inmunidad adaptativa en el tracto respiratorio, estudiando su influencia sobre la inmunidad adaptativa humoral y celular contra S. pneumoniae o contra distintos antígenos empleados en vacunas comerciales (PPV, PCV) o experimentales (PSPF). C. pseudodiphtheriticum 090104 y su BLP incrementaron la producción de anticuerpos específicos contra S. pneumoniae tanto en el tracto respiratorio (IgA e IgG) como a nivel sistémico (IgM, IgG e IgA) así como los niveles de TNF-α, IFN-γ e IL-4, los cuales se correlacionaron con un aumento en la resistencia a la infección neumocócica. La cepa 090104 y su BLP aumentaron además la capacidad de tres vacunas neumocócicas (PPV, PCV y PSPF) de inducir anticuerpos específicos en el tracto respiratorio y en suero, así como de proteger contra la infección primaria con diferentes serotipos de S. pneumoniae, y contra la infección secundaria producida luego del daño inflamatorio pulmonar mediado por el agonista de TLR3 poly(I:C). Finalmente, se efectuaron estudios in vivo, in vitro e in silico destinados a la caracterización fenotípica y genómica de C. pseudodiphtheriticum 090104. Los resultados demostraron la capacidad de la BCR para agregar, cambiar el fenotipo e inhibir el crecimiento de patógenos respiratorios. Se realizaron además ensayos in vivo para analizar la seguridad de la administración nasal de diferentes dosis de la bacteria en ratones infantes y adultos, los cuales se complementaron con análisis in silico empleando el genoma de C. pseudodiphtheriticum 090104, destinados a evaluar genes asociados a su funcionalidad y seguridad. Este trabajo es el primero en demostrar que es posible utilizar BCR para regular beneficiosamente la respuesta inmune contra S. pneumoniae, y que dicha actividad inmunomoduladora es una propiedad dependiente de cada cepa. Los resultados de este trabajo significan un importante avance en el conocimiento de las funciones beneficiosas de miembros de la microbiota respiratoria, al demostrar su habilidad para modular la inmunidad innata y adaptativa e incrementar la resistencia a la infección neumocócica. Los resultados brindan además las bases científicas para proponer a las BCR y a sus BLP como adyuvantes de la mucosa respiratoria que pueden ser empleados en el desarrollo de nuevas formulaciones vacunales destinadas prevención de infecciones respiratorias.Item Caracterización e identificación de fitoquímicos (semioquímicos y bioinsecticidas) para el control de insectos plagas de maíz (Zea mays L.)(Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, 2024) Paliza, María Laura; Nazareno, Mónica Azucena; Coll Araoz, VictoriaItem Efecto del oviducto en la capacitación de espermatozoides epididimarios Chinchilla lanigera(Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, 2024) Medina, María Fernanda; Bühler, Marta I.Las especies de Chinchilla spp. son nativas de la Cordillera de los Andes y se encuentran protegidas debido a su estado de peligro de extinción, causado por la caza indiscriminada, por el valor de su pelaje y la pérdida de su hábitat natural. En la actualidad, la especie doméstica se cría con fines comerciales bajo esquemas endogámicos de reproducción, con la finalidad de mantener las características fenotípicas de su piel. Sin embargo, la tasa de reproducción en cautiverio es baja, con periodos reproductivos estacionales, tiempos largos de gestación y pocas crías por parición. Las técnicas de reproducción asistida representan una alternativa efectiva a esta situación, disminuyendo el efecto endogámico del sistema de cría y ampliando el reservorio génico. En este sentido, el estudio de la importancia que tiene el oviducto en la fisiología de espermatozoides epididimarios obtenidos de animales faenados, representa una herramienta de gran utilidad para el mejoramiento del rendimiento de estas gametas posmortem. En este trabajo se describió por primera vez el oviducto de Chinchilla lanigera reconociendo las regiones del Infundíbulo, Ampolla e Istmo. Los resultados obtenidos del análisis histológico, histoquímico y morfométrico muestran un comportamiento región-dependiente reportado en otras especies de mamíferos. La obtención de medios condicionados oviductales (MCO) resultó una buena estrategia para la extracción de fluido oviductal. Se propuso, además, por primera vez una variante en la obtención de MCO al incubarlos a 4 ˚C. Se registraron concentraciones proteicas entre 22-24 mg/ml tanto en los MCO obtenidos a 37 °C (Ø) como a 4 °C (f). En el estudio cualitativo de los MCO por eletroforesis SDS-PAGE, se reconocieron 3 bandas comunes en los MCOf y MCOØ, y una banda diferencial de 43 kDa sólo en los MCOf. En una segunda etapa se valoró el efecto inductor de los MCOs sobre la capacitación de los espermatozoides, evaluando indirectamente la reacción acrosómica (RA) inducida por progesterona. Los mejores porcentajes de capacitación se registraron con los MCOf incluso superando al control positivo de HTF. Estos resultados muestran que los MCO obtenidos en el laboratorio presentan propiedades capacitantes específicas de especie. Finalmente, se estudió la interacción espermatozoide-oviducto valorando la ocurrencia de contacto espermático bajo el efecto capacitante del MCOf. Se emplearon oviductos de chinchilla y vaca ajustando las experiencias a 2 modelos de interacción homólogo y heterólogo. En todos los casos se encontraron espermatozoides no capacitados tomando contacto con las células ciliadas, mientras que las gametas que habían gatillado su RA no fue posible corroborar su presencia. Mediante el cultivo celular en monocapa de células oviductales bovinas (CEOB) se registró un comportamiento similar a los observados en los ensayos con secciones de oviductos. Las gametas con su acrosoma intacto toman contacto con su cara plana ventral o dorsal con las células en monocapa. Este trabajo de tesis constituye un aporte importante al conocimiento reproductivo de la especie, dando herramientas para el mejoramiento en el diseño de los medios empleados tanto en la capacitación como la fecundación in vitro. Estos avances permitirán desarrollar mejores protocolos de reproducción asistida adecuados a la especie.Item Enteroccocus gallinarum CRL 1826 como bioinsumo para mejorar parámetros biométricos en rana toro(2024) Acevedo, María Andreína; Pasteris, Sergio Enrique; Llanos, Ricardo JavierLithobates catesbeianus (rana toro) constituye la especie de elección para ranicultura pecuaria, actividad que ha adquirido importancia a nivel mundial para las industrias alimenticia y farmacéutica. Enterococcus gallinarum CRL 1826 es una bacteria láctica autóctona (BLA) de rana toro. Debido a sus características benéficas que incluyen actividad antimicrobiana frente a patógenos asociados al síndrome de la pata roja (SPR) y Listeria monocytogenes (contaminante de carne de rana), propiedades asociadas a su capacidad de adhesión y colonización (hidrofofibidad, autoagregación, producción de exopolisacáridos y formación de biofilm) y de seguridad in vitro (sensibilidad a quimioterapéuticos y ausencia de factores de virulencia) e in vivo (ausencia de translocación cuando se administraron cultivos frescos hasta 30 días de desarrollo embrionario), esta BLA fue seleccionada como potencial probiótico para ranicultura pecuaria. Sobre la base de lo expuesto, en este trabajo de Tesis Doctoral se evaluó: a- la viabilidad y el mantenimiento de propiedades benéficas de E. gallinarum CRL 1826 luego del proceso de liofilización y almacenamiento durante 24 meses a 4 y 25°C y cuando la cepa fue sometida a la acción de factores gastrointestinales (pH, bilis y enzimas digestivas) de manera individual y en un modelo de digestión gastrointestinal simulada, y b- el efecto de la administración de la BLA liofilizada sobre parámetros biométricos, microbiológicos y de seguridad en renacuajos de rana toro de 30 a 60 días. Así, se demostró que la BLA liofilizada presentó resistencia intrínseca al proceso de liofilización considerando su comportamiento en agua destilada (control), mientras que se observó la máxima sobrevida en leche (5%) + sacarosa (5%) durante 24 meses de almacenamiento a 4 y 25°C. Además, mantuvo su capacidad de producir una sustancia tipo bacteriocina que inhibe a L. monocytogenes Scott A, actividad que disminuyó durante su almacenamiento, principalmente a 25°C. Cuando la BLA liofilizada y almacenada 1 mes fue administrada a renacuajos, se observó un incremento de 4-9% en parámetros biométricos (peso y longitud). En la condición BLA + balanceado, aumentaron significativamente las poblaciones de BL, disminuyeron las de Pseudomonas spp. y las enterobacterias no se modificaron. Finalmente, la administración de la BLA no produjo efectos adversos en hospedador. Considerando que el boinsumo se aplicará en condiciones de criaderos en ejemplares juveniles y adultos que poseen un tracto gastrointestinal completamente desarrollado, se realizó un análisis comparativo de la acción de los factores gastrointestinales en cultivos frescos (F), liofilizados (L) y almacenados (A). En general, los cultivos L y A crecieron/resistieron las condiciones individuales y presentaron actividad relativa de la sustancia tipo bacteriocina producida por la BLA. Estos cultivos mantuvieron, además, su viabilidad y sus propiedades de superficie cuando se estudió a la BLA en un modelo de digestión gastrointestinal simulada. Este trabajo de Tesis permite avanzar en el diseño de un bioinsumo con E. gallinarum CRL 1826 de aplicación en ranicultura para mejorar parámetros biométricos y, así, reducir los tiempos de producción animal y potencialmente la incidencia de patógenos asociados al SPR.Item Estrés oxidativo e inflamación en neoplasias hematológicas agudas(Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, 2024) Agüero Aguilera, Ana Carolina; Haro, Ana Cecilia; Lazarte, Sandra StellaLa generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y la respuesta citoprotectora son esenciales para la quiescencia, autorrenovación y supervivencia de las células madre hematopoyéticas. No obstante, su influencia en la patogénesis y evolución de las neoplasias hematológicas agudas aún no se ha dilucidado completamente. La sobreproducción de ERO está asociada con inflamación no resuelta, condición que contribuye a la necrosis celular y tisular, exacerbando la complejidad de esta patología. El objetivo de esta tesis fue estudiar el comportamiento de biomarcadores redox e inflamatorios a nivel sistémico y transcripcional en leucemias agudas (LA) de reciente diagnóstico, y su relación con el factor de transcripción NRF2, un modulador clave del equilibrio redox. Se evaluaron 92 pacientes con debut de LA y 68 controles sanos (CTRL). Las LA se clasificaron en: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia promielocítica aguda (LPA) y leucemia mieloide aguda (LMA). A nivel sistémico se evaluó a) la generación de especies reactivas mediante la concentración de malondialdehído (MDA) y nitritos, b) las defensas antioxidantes: catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión (GSH), y c) las citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α. A nivel transcripcional, se estudió la expresión de NRF2 y sus genes diana CAT, SOD, peroxiredoxina-2 (PRX-2), así como TNF-α e IL-6, mediante RT-qPCR. Finalmente, se evaluó la capacidad de GPx e IL-6 como marcadores discriminativos para el diagnóstico de LA. Los resultados mostraron un aumento significativo de MDA en las LMA (p < 0,05), acompañada de una mayor actividad de CAT respecto al CTRL. Se observaron niveles elevados de GPx y GSH en todas las LA. Se detectaron menores niveles de ARNm de SOD en todas las LA respecto al CTRL, aunque la expresión de NRF2 fue similar entre los grupos. En las LMA, se observó una menor expresión de IL-6 y una expresión similar de TNF-α, acompañada de una concentración sérica elevada de IL-6 y disminuida de TNF- α en comparación al CTRL. Por otro lado, los resultados indicaron que la asociación de NRF2 con las enzimas antioxidantes varía según el tipo de leucemia. En LPA, se identificó una fuerte asociación positiva entre la expresión de NRF2 y los genes PRX-2 y SOD. Asimismo, se reveló que el perfil inflamatorio varía según el patrón de diferenciación celular. En LMA con diferenciación mielomonocítica/monocítica se observó un aumento significativo de IL-6 (p < 0,05), mientras que niveles disminuidos de TNF-α se detectaron sólo en aquellas con diferenciación granulocito neutrófilo. Por último, los niveles de GPx ≥ 11,64 µmol/mg proteína y de IL-6 ≥ 4,32 pg/mL se asociaron fuertemente con la presencia de LA. Esta tesis constituye uno de los primeros informes que correlacionan parámetros transcripcionales y sistémicos vinculados al estado oxidativo-inflamatorio en LA al momento del diagnóstico. Los hallazgos confirman la presencia de un desequilibrio redox en estos pacientes, y además sugieren que ciertas mediciones podrían tener un valor predictivo como indicadores de riesgo para el desarrollo de LA. Dichos biomarcadores potenciales facilitarían la selección de estrategias terapéuticas más eficaces para el tratamiento de la misma.