Detecção de ácidos glicônicos totais por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em matriz derivada de cultivo microbiano (CLAE)

Abstract

A capacidade de produzir ácidos orgânicos e tolerar à acidez é peculiar da bactéria fixadora de nitrogênio Gluconacetobacter diazotrophicus. Além da importante aplicação industrial, diversos ácidos orgânicos, entre eles os ácidos glicônicos, tem sido relatados como responsáveis pela solubilização de diversos compostos encontrados em forma não assimilável no solo. Neste contexto a utilização de métodos que permitam quantificar a produção desses ácidos é essencial para estabelecer seu papel na promoção de crescimento vegetal. No entanto, devido a grande semelhança estrutural entre o substrato (D-Glicose) e os ácidos glicônicos, a determinação específica e quantitativa destes compostos em relação a seu açúcar precursor tem sido limitada mesmo em análises empregando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O protocolo apresentado propõe o uso de dois métodos de detecção para definir a quantidade de glicose e ácidos glicônicos em amostras derivadas de cultivos in vitro de G. diazotrophicus: por método enzimático-colorimétrico (comercial) e detecção por CLAE. Embora não tenha sido possível a separação do ácido D-glicônico de seus ceto derivados, o método demonstrou baixa interferência da presença de D-glicose e alta linearidade de resposta para detecção de ácidos glicônicos totais. Análise quantitativa destes compostos em amostras de sobrenadantes permitiu definir que 33,10 mg de ácidos glicônicos totais ml-1 foram produzidos durante o cultivo de G. diazotrophicus. As condições cromatográficas estabelecidas neste estudo constituem uma ferramenta para identificação e caracterização de microrganismos capazes de promover a solubilização de fosfato e outros minerais por meio da síntese de ácidos glicônicos.

The ability to produce organic acids and tolerates acidity is peculiar of the nitrogen-fixing bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Besides the industrial application, various organic acids, including gluconic acids have been shown to be responsible for solubilization of various compounds found in non-available forms in the soil. For this reason, development of methods to quantify the production of these acids is essential to establish their role in plant growth promotion. However, due to their close structural form specific and quantitative determination of the substrate (D - glucose) and gluconic acids and its derivatives has been limited by High Performance Liquid Chromatography analysis (HPLC). The protocol presented here proposes the use of two detection methods to determine the amount of glucose and total gluconic acids in samples derived from in vitro cultures of G. diazotrophicus: enzyme-colorimetric (commercial) and by HPLC detection. Although it was not possible to separate the D - gluconic acid from their ketoderivatives, the method showed low level of D-glucose interference and very high linearity for the detection of total gluconic acids. The quantitative analysis of these compounds in samples of PAL5 culture supernatants indicated that 33,10 mg of total gluconic acids ml-1 were produced during growth of G. diazotrophicus. The chromatographic conditions analysis established in this study can be used as a tool for identification and characterization of microorganisms capable of promoting the solubilization of phosphates and other mineral by synthesizing total gluconic acids.