Avances en la formulación de probióticos para la prevención de quitridiomicosis en anfibios amenazados en condiciones de cría ex situ

Abstract

Los anfibios cumplen un rol ecológico clave tanto en las cadenas tróficas. La principal causa de la declinación global de anfibios es la “quitridiomicosis”, una enfermedad infecciosa emergente causada por Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). Este hongo coloniza y prolifera en células queratinizadas. Los animales infectados sufren un desequilibrio osmótico con posterior falla cardíaca, se inhibe el funcionamiento de linfocitos y se afectan vías metabólicas esenciales. El control de Bd en la naturaleza es dificultoso, ya que los anfibios pueden albergar múltiples genotipos incluyendo: BdGPL (Global Panzootic Linage), BdHíbrido y linajes endémicos. Actualmente, existe solo una intervención eficaz con compuestos antifúngicos para erradicar Bd, pero tiene efectos nocivos sobre la microbiota del huésped y del ecosistema. De este modo, los probióticos representan una alternativa sustentable para restaurar las poblaciones microbianas benéficas y, así, prevenir brotes de quitridiomicosis. En este sentido, solamente se ha informado el uso de probióticos formulados con especies bacterianas autóctonas de piel de anfibios que no incluyen a las bacterias lácticas (BL). Considerando que Lithobates catesbeianus (rana toro) es una especie portadora de Bd y que las BL integran la microbiota de piel de estos anfibios en condiciones de criaderos, en este trabajo de Tesis Doctoral se seleccionaron BL autóctonas (BLA) para evaluar su potencial probiótico para la prevención de la quitridiomicosis. Así, se determinó la actividad antagónica de 2 BLA y 60 BLAp (bacterias lácticas autóctonas presuntivas) frente a genotipos virulentos de Bd: UM142 (BdASIA-2/BdBrazil), CLFT024.02 y 159 (BdHíbrido y BdGPL), CLFT001 (BdGPL linage), AVS 4, AVS 7, C2A y VA02 (BdGPL). Se evaluaron propiedades de superficie de las BLA y BLAp (hidrofobicidad y autoagregación), producción de exopolisacáridos (EPS), y formación de biofilm. Asimismo, se realizaron estudios de compatibilidad entre los microorganismos y análisis por RAPD-PCR para, finalmente, seleccionar e identificar BLAp por secuenciación genómica del ADNr 16S. Se preseleccionaron 18 BLA como potenciales probióticos utilizando dos criterios: 1) aislados con actividad antifúngica frente al menos dos cepas de Bd de diferentes linajes y la expresión de una propiedad de adhesión/colonización (hidrofobicidad, autoagregación, EPS o producción de biofilm), y 2) aislamientos sin actividad anti-Bd y la expresión de al menos dos propiedades de adhesión/colonización. Posteriormente, se evaluó la capacidad de las 18 BLA de tolerar las condiciones del huésped. Así, se estudió la adhesión a mucus de Leptodactylus macrosterum y a una línea celular queratinizada (HaCat). Además, se determinó la resistencia de las 18 BLA y de Citrobacter freundii a péptidos antimicrobianos de piel de Leptodactylus macrosterum, Phyllomedusa sauvagii y Rhinella arenarum. Estos resultados permitieron seleccionar a Pediococcus pentosaceus 16B, Enterococcus thailandicus 31 y Levilactobacilus brevis 41B. Las cepas de BLA se conservaron por liofilización y secado por aspersión, y se evaluó su sobrevida a estos procesos y durante el almacenamiento (4 meses). Este trabajo de Tesis sienta las bases para el diseño de un probiótico con potencial aplicación en centros de conservación y rescate ex situ de anfibios amenazados y en peligro de extinción.