GAPDH como nueva proteína de unión a glicosaminoglicanos en la matriz extracelular y su posible implicancia en enfermedades neurodegenerativas

Abstract

Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es considerada una proteína multifuncional por su capacidad de desarrollar diferentes funciones en adición a su rol glicolítico. Esta plasticidad funcional se logra mediante cambios conformacionales que exponen nuevas superficies de interacción con otras proteínas. De esta manera, ciertos glicosaminoglicanos inducen la formación de especies multiméricas de GAPDH con capacidad para actuar como chaperonas en el espacio extracelular secuestrando agregados tóxicos de α-sinucleína. Este rol proteostático puede verse afectado como consecuencia de los cambios en los patrones de sulfatación de los glicosaminoglicanos asociados al envejecimiento. Por tanto, la administración de glicosaminoglicanos representaría una nueva estrategia terapéutica para sinucleinopatías como la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, el efecto anticoagulante de algunos glicosaminoglicanos de uso terapéutico, tales como la heparina, limita su uso en tratamientos prolongados. En la presente tesis se caracteriza por primera vez a nivel molecular la unión de los glicosaminoglicanos a GAPDH y se propone un método para revelar el mecanismo de formación de la protofibra neuroprotectora. En primer lugar, se estableció que el largo de la cadena del glicosaminoglicano influye tanto en su capacidad de unirse a GAPDH como en inducir su agregación. Mientras que para la unión se estableció que la unidad mínima estaría conformada por un trisacárido, para inducir la agregación se necesita una cadena compuesta por quince unidades de sacáridos. Por este motivo se utilizó fondaparinux, un pentasacárido sintético, como una molécula modelo para estudiar en el equilibrio el proceso de unión de glicosaminoglicanos a GAPDH sin que el mismo evolucione hacia la formación de protofibras neuroprotectoras. Mediante estudios de unión basados en cambios en la fluorescencia intrínseca del triptófano, se pudo establecer la constante de disociación (KD) de heparina y fondaparinux a GAPDH. El valor obtenido es consistente con una proteína de afinidad media por heparina. Por otra parte, se resolvió la estructura de la proteína GAPDH en complejo con fondaparinux utilizando cristalografía de rayos X. El análisis de datos del cristal permitió determinar el sitio de unión de la molécula de heparina a GAPDH y los residuos aminoacídicos fundamentales en la unión. Mediante estudios in silico se pudieron establecer los grupos sulfato de los glicosaminoglicanos relevantes para la unión en base a su contribución relativa a la energía de unión. Por último, por mutación sitio dirigida se obtuvieron las mutantes simples W196Y, W313Y y la mutante doble W196YW313Y de GAPDH. Estas proteínas mutantes se utilizaron para revelar los cambios que ocurren en la fluorescencia intrínseca de los triptófanos durante el proceso de agregación constituyéndose en una herramienta versátil y de fácil acceso, para la evaluación de farmacomiméticos. Estos resultados constituyen un valioso aporte al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para frenar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson. La determinación de los farmacóforos en los glicosaminoglicanos sienta las bases necesarias para el diseño de moléculas capaces de unirse a GAPDH y potenciar su efecto neuroprotector de GAPDH en el espacio extracelular.