Aplicación de microscopía Raman al análisis de cambios estructurales de ovocitos bovinos durante la maduración in vitro

Abstract

En los últimos años, numerosos estudios se han centrado en la optimización de la producción de embriones in vitro (PIV) de animales de interés productivo, entre ellos los bovinos. La maduración in vitro (MIV) de los ovocitos es la primera etapa de la PIV y puede determinar el rendimiento del proceso y la calidad del futuro embrión. Un conocimiento profundo de los cambios bioquímicos que experimenta esta célula en el proceso de maduración permitirá optimizar las condiciones de la MIV, con el fin de lograr un mayor número de ovocitos competentes. El objetivo de esta Tesis fue explotar la potencialidad de la microscopía Raman para evaluar el contenido de los principales bio-componentes del ovocito bovino y monitorear sus características espectrales durante el proceso de MIV. El análisis espectral de las propiedades bioquímicas y estructurales, tanto de la zona pelúcida (ZP) como del citoplasma, de ovocitos sometidos a MIV fue complementado con métodos estadísticos multivariados. Se analizaron y compararon espectros de ovocitos inmaduros y madurados in vitro durante 6, 18 y 22 h. Se identificaron bandas de vibración específicas que mostraron una significativa diferencia espectral a lo largo del proceso de maduración, las que se asociaron a moléculas de glicoproteínas de la ZP y de lípidos, proteínas y azúcares del citoplasma. Los espectros de la ZP indicaron una disminución paulatina de la intensidad de las bandas de los residuos acetamida, presentes en el dominio glicosídico, mientras que las bandas proteicas se intensificaron marcadamente en las primeras 6 h de maduración. La señal correspondiente al ácido siálico, glúcido involucrado en la unión del espermatozoide a la ZP en la especie bovina, mostró su intensidad máxima en el espectro de 22 h. Tras la eliminación enzimática de la ZP, se realizó un análisis detallado de los cambios bioquímicos en el citoplasma, observándose un marcado incremento de las reservas lipídicas de los ovocitos a partir de las primeras 6 h de la maduración y un aumento relevante del contenido proteico recién entre las 18 y 22 h del proceso. La intensidad relativa de las bandas de proteínas resultó estadísticamente significativa para diferenciar entre ovocitos maduros e inmaduros. Adicionalmente, se estudiaron los cambios producidos en el citoplasma de ovocitos madurados in vitro en un medio enriquecido con el factor de crecimiento del endotelio vascular-D (VEGF-D). El análisis espectral demostró que el contenido proteico es mayor en ovocitos madurados en presencia de dicho factor que en los controles (madurados sin VEGF-D) tanto a las 18 como a las 22 h, produciendo un aumento significativo en el porcentaje de ovocitos maduros. En conclusión, esta Tesis aporta información novedosa y relevante sobre las modificaciones globales del contenido bioquímico de los ovocitos bovinos a través de la aplicación de la microscopía Raman, conforme procede la maduración de los mismos. Además, sienta las bases para la evaluación del estado madurativo de ovocitos sometidos a MIV con medios de maduración modificados, a fin de asegurar el éxito de su fecundación in vitro y posterior desarrollo embrionario.